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蔡司激光共聚焦显微镜的光谱分光特性以及光谱拆分

   通常情况下,在荧光成像设备的分辨率的角度来看,宽场荧光显微镜→激光共聚焦显微镜→*高分辨率荧光成像设备的分辨率依次提升,面对微生物这样比动物细胞小10倍以上的微生物,我们该如何选择合适的成像设备呢?通过下面三个案例,我们来看看不同设备下微生物的庐山真面目。

  01

  PNAS/微米尺度下的人类口腔微生物地理形态

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  微生物复杂的空间群落对于理解群落中各类群间的相互作用至关重要,本文引入为生物地理学的概念,研究微生物的分布与环境在微米尺度上的关系。借助DNA测序提供的不同类群丰富的基因组序列信息,研究人员利用荧光原位杂交技术同时标记9种类群的微生物,通过激光共聚焦显微镜光谱成像,发现人类牙菌斑的多属且高度组织化的微生物群落——独特的“多属联合体”。共聚焦多层采集重构出的3D结果显示,联合体尺寸从几十微米到几百微米不等,由一个放射状排列的9个单元组成,丝状、棒状杆菌围绕在其周围。并且该联合体呈现出单个类群空间排布的差异性:比如厌氧类群倾向于内部定位,而兼性或专性需氧类群倾向于排列在联合体外部;代谢产物乳酸的生产者和消费者往往彼此靠近等。丰富的结构差异影响微生物的生理和生态特性,这为理解微生物组织、代谢和系统生物学提供了重要的空间模型和组织框架。

  亮点:在可见光范围内选择的多色荧光染料,分别标记不同细菌,本文选择9种荧光标记,极易出现串色,利用蔡司激光共聚焦显微镜的光谱分光特性以及光谱拆分(点击查看),可以准确区别9种标记避免串色。同时,利用共聚焦良好的光切效果,进行多层扫描获得xyz三维立体数据,重构菌落立体结构。

  

蔡司共聚焦显微镜

 

  ▲左图:牙菌斑中的“花椰菜”结构,主要由樟脑菌属、链球菌属、嗜血杆菌/聚集菌和脉管菌组成,其中还分散排布普雷沃菌、罗西亚菌和噬帽菌。右图:牙菌斑中复杂的“玉米芯”结构。设备:LSM 780

  

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  ▲图示:通过光学多色成像数据,构建的牙菌斑的刺猬状菌落模型。链球菌和放线菌的生物膜上结合棒状杆菌菌丝,在菌丝远端被球状菌(链球菌、卟啉单胞菌等)包裹形成玉米穗状结构,丛生的奈瑟菌包围在菌落外侧。外侧的细菌构建了一个富二氧化碳低氧的环境,厌氧菌在内部生长。

  02

  Nature communications/细菌脂多糖膜的活化是非经典炎症信号转导途径的第一步

  

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  细胞焦亡是一种机体在感知病原微生物侵染后启动的免疫防御反应,本质上是一种程序性细胞坏死,它的表现为细胞膜形成孔洞、逐渐膨胀至细胞膜破裂等,最终导致细胞内容物释放并引起剧烈的炎症反应。细胞焦亡又分为经典与非经典通路,在非经典通路中,以细菌脂多糖(LPS)为例,前人研究表明它不需要借助受体就可以直接进入细胞质,进而使LPS受体——Caspase 家族成员发生寡聚而活化,切割gasdermin-D,诱导细胞焦亡的发生。本文研究则发现,宿主细胞中的GBP1起到细菌脂多糖(LPS)感受器的作用,通过静电作用高亲和结合沙门氏菌表面的LPS,并且通过招募GBP2-4组装成GBP coat,进一步促进capspase-4募集于细菌表面并发生活化,证实细菌脂多糖膜的活化使开启非经典炎症信号转导途径的第一步。

  亮点:直径2-3um的沙门氏菌,通过蔡司共聚焦上搭载的*高分辨设备Airyscan(点击查看),有效实现2倍分辨率提升,清楚定位GBPs在细菌表面(类似膜结构的成像效果)的结合和募集。

  

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  ▲图示:沙门氏菌(rsRED标记,红色)侵染Hela细胞,胞内的非典型炎症小体GBP1(eGFP标记,绿色)结合沙门氏菌表面。细胞核(Hoechst标记,蓝色),标尺:10um(C)5um(F)。设备:LSM 800 with Airyscan。

  03

  Cell/大肠杆菌的亚细胞结构3D成像

  

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  炎症小体是一种由细胞质内天然免疫识别受体参与组装的多蛋白复合物,可以应答病原微生物入侵,驱动caspase-1的激活、细胞焦亡的发生和促炎症因子IL-1β and IL-18的释放。本文发现,干扰素诱导蛋白IRGB10对新弗朗西斯菌激活AIM2炎症小体是必不可少的,并促进革兰氏阴性细菌侵染宿主后激活caspase11和NLRP3炎症小体。该过程中,IRGB10靶向结合胞内细菌配体,并定位于细菌细胞膜附近,从而损害细菌结构的完整性,同时IRGB10介导细菌配体在胞内的释放,进而被炎症小体传感器识别,引发机体免疫。

  亮点:利用普通的激光共聚焦观察直径仅有2um左右的大肠杆菌,可以看到其棒状形态,但很难看到其内部的亚细胞结构,所以作者利用蔡司*高分辨成像系统Elyra(点击查看)(SIM分辨率: xy 120nm,z 300nm)对进行亚细胞定位的3D成像,可以清晰看到IRGB10位于大肠杆菌DNA与LPS之间的独特的结构位置。